免疫治疗，尤其是程序性死亡受体1(PD-1)和(或)程序性死亡配体1(PD-L1)免疫检查点抑制剂，重塑了肿瘤治疗模式，在包括非小细胞肺癌(NSCLC)在内的多种肿瘤治疗中部分患者均获得了显著的临床获益。如何筛选PD-1和(或)PD-L1抑制剂潜在获益人群成为免疫治疗时代面临的新挑战。NSCLC中PD-L1蛋白表达水平与PD-1和(或)PD-L1抑制剂疗效呈正相关，是重要的预测标志物之一。明确PD-L1检测的临床意义和检测时机，在PD-L1检测步骤、结果判读和质量控制等各个环节实现PD-L1检测的规范化和标准化，对提高检测的准确性和降低室间差异具有重要意义。针对PD-L1检测的实际问题，在结合文献、专家经验和委员会成员内部讨论基础上，最终达成此共识，以期规范PD-L1检测，为临床医师提供准确可靠的治疗依据以及给予临床检测一定的指导。必须指出的是，鉴于PD-L1检测客观复杂因素的存在以及国内PD-L1检测尚处于临床应用初期，此专家共识尚存在不足之处，期待未来有更多的研究和实践数据进一步完善。
【主题词】非小细胞肺癌;程序性死亡配体1;检测;专家共识
DOI:10.3760/cma.j.cn112152-20200313-00202
肺癌是全球范围内恶性肿瘤死亡的主要原因，其中非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer, NSCLC)占85%，大部分患者确诊时已为中晚期或早期患者术后发生复发转移。尽管近年来分子靶向治疗在一定程度上取得了成功，但仍不可避免发生获得性耐药和疾病进展，同时驱动基因野生型NSCLC患者的治疗方法有限，迫使临床寻求其他有效的治疗手段。目前，多项临床研究显示，免疫治疗，尤其是免疫检查点抑制剂，如程序性死亡受体1(programmed death 1， PD-1)和(或)程序性死亡配体1(programmed cell death-ligand 1, PD-L1)抑制剂等，可使包括NSCLC在内的多种类型肿瘤获得明显的临床获益。
肿瘤细胞可通过高表达PD-L1与T细胞表面的PD-1结合，抑制T细胞的免疫效应，从而实现免疫逃逸。PD-1和(或)PD-L1抑制剂治疗的原理正是通过阻断PD-1和(或)PD-L1通路进而激活机体抗肿瘤免疫反应。有研究显示，PD-1和(或)PD-L1抑制剂能显著延长晚期NSCLC患者的无进展生存时间(progression-free survival, PFS)和总生存时间(overall survival, OS)，同时PD-L1的表达水平与PD-1和(或)PD-L1抑制剂治疗的效果有关。美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration, FDA)已批准帕博利珠单抗(Pembrolizumab)、纳武利尤单抗(Nivolumab)和阿替利珠单抗(Atezolizumab)用于晚期NSCLC患者的治疗，度伐利尤单抗(Durvalumab)用于Ⅲ期不可切除NSCLC患者放化疗后的巩固治疗，同时FDA批准4种商业化PD-L1检测试剂盒作为伴随诊断或补充诊断用于临床检测。在我国，PD-1、PD-L1抑制剂及PD-L1检测试剂盒也已逐步上市，应用于NSCLC的诊断和治疗。
尽管免疫组织化学(immunohistochemistry, IHC)检测PD-L1表达水平可作为一种免疫治疗的预测标志物，用于筛选潜在获益人群和预测疗效，但PD-L1检测实践和结果判读仍存在很多问题和挑战。针对PD-L1检测的实际问题，在结合文献、专家经验和委员会成员内部讨论的基础上，最终达成此次共识，以期为规范PD-L1检测和为临床医师提供准确可靠的治疗依据给予一定的实践指导。必须指出的是，鉴于PD-L1检测客观复杂因素的存在以及国内PD-L1检测尚处于临床应用初期，此专家共识内容尚存在不足之处，期待未来有更多的研究和实践数据进一步完善。
一、PD-L1表达检测的临床意义
1. PD-L1表达检测可作为伴随诊断指导PD-1和(或)PD-L1单抗药物的治疗决策:PD-L1表达检测结果对临床医师制定治疗方案和预测治疗疗效有重要意义，尤其是对帕博利珠单抗的临床用药指导有至关重要的意义。KEYNOTE024研究将帕博利珠单抗用于一线治疗PD-L1高表达[肿瘤细胞阳性比例分数(tumor proportion score, TPS)≥50%]、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)和(或)间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase, ALK)突变阴性的晚期NSCLC患者，结果显示，与含铂类化疗药物比较，帕博利珠单抗显著改善了患者的客观有效率(objective response rate, ORR)、PFS和OS。KEYNOTE042在此基础上进一步验证了TPS≥1%的人群，结果显示，帕博利珠单抗与含铂类化疗药物比较，患者临床获益显著。KEYNOTE010研究结果显示，帕博利珠单抗较标准化疗方案能够显著改善既往接受过治疗的PD-L1阳性(TPS≥1%)局部晚期或转移性NSCLC患者的OS，且PD-L1表达水平越高，临床获益越大。基于上述研究结果，帕博利珠单抗被批准用于一线治疗PD-L1阳性(TPS≥1%)、EGFR和(或)ALK突变阴性的转移性或晚期NSCLC患者。
IMpower110研究结果显示，与铂类药物化疗比较，接受阿替利珠单抗治疗的PD-L1高表达[肿瘤细胞(tumor cells, TC)≥50%或免疫细胞(immune cells, IC)≥10%]患者的OS得到改善，基于这一结果，FDA批准阿替利珠单抗单药一线治疗PD-L1高表达(TC≥50%或IC≥10%)的EGFR和(或)ALK阴性的转移性NSCLC患者。
此外，PACIFIC研究结果显示，度伐利尤单抗作为放化疗结束后无疾病进展的不可切除的局部晚期NSCLC患者的巩固治疗，在TPS≥1%的患者中，能够显著改善患者的PFS和OS。因此，欧盟批准其用于放化疗结束后无疾病进展的不可切除局部晚期Ⅲ期NSCLC患者的巩固治疗，其中PD-L1检测(TPS≥1%)为伴随诊断。
2. PD-L1表达检测可作为补充诊断协助筛选免疫治疗潜在获益人群:补充诊断即非治疗药物决策所必须，但可以提供个体治疗相关信息的检测，如缺乏检测结果或检测结果为阴性亦可进行用药。CheckMate017和CheckMate057研究结果显示，纳武利尤单抗用于治疗晚期鳞状或非鳞状NSCLC患者，与多西他赛比较，纳武利尤单抗能够提高患者的ORR、PFS和OS。基于此两项研究，FDA批准纳武利尤单抗用于以铂类为基础化疗方案进展后的晚期(转移性)鳞状或非鳞状NSCLC患者。POPLAR研究显示，与多西他赛比较，阿替利珠单抗治疗既往含铂类化疗药物治疗失败的NSCLC患者能够提高患者的OS。OAK研究进一步验证了POPLAR研究结果，同时表明，无论PD-L1表达状态和组织学分型，阿替利珠单抗均较多西他赛具有明显生存获益。因此，FDA批准阿替利珠单抗用于接受含铂类化疗药物后疾病进展的转移性NSCLC患者。尽管纳武利尤单抗和阿替利珠单抗二线治疗NSCLC患者均无需考虑PD-L1状态，但有研究结果显示，PD-L1表达水平越高，临床获益越大。因此，在一定程度上PD-L1的检测结果可辅助临床选择更适宜免疫治疗的潜在人群。
除此以外，通过IHC检测手术切除标本的PD-L1表达水平，一定程度上能为临床医师提供患者的预后信息。尽管研究结果并不完全一致，但有研究显示，PD-L1高表达水平与患者较短的OS有关。目前，有关PD-L1表达水平的预后价值尚有待进一步阐明。
二、目前国内外获批上市的PD-1和(或)PD-L1单抗药物
1. FDA批准上市的PD-1和(或)PD-L1单抗药物:目前，FDA批准了6家国外公司的PD-1和(或)PD-L1单抗药物，其中3种为PD-1单抗[帕博利珠单抗、纳武利尤单抗和西米普利单抗(Cemiplimab)]，3种为PD-L1单抗(表1)。
2. 国内批准上市的PD-1和(或)PD-L1单抗药物:国内批准上市的PD-1和(或)PD-L1单抗药物见表2。
三、PD-L1检测的标本类型
1. 经10%中性福尔马林固定、石蜡包埋的肿瘤组织样本是检测PD-L1表达的标准标本类型。手术切除标本和活检标本均可进行PD-L1检测，对于术后复发患者，优先建议对复发和(或)转移病灶进行活检后检测，若无法获取复发灶或转移灶标本，可使用手术切除标本，活检标本应确保有足够的肿瘤细胞进行评估。
2. 在组织学标本不可获得的情况下，可尝试用细胞学蜡块标本进行PD-L1检测，但在报告中应予以必要的说明。
3. 原发灶和转移灶均可用于PD-L1检测。由于转移灶和原发灶PD-L1表达可能存在差异，建议必要时对原发灶和转移灶分别进行PD-L1检测，以明确PD-L1表达状态。
4. 由于PD-L1具有时间异质性且受治疗影响，因此，初诊时和更换治疗方案前均建议进行PD-L1检测。
5. 避免使用脱钙标本进行PD-L1检测。
由于肿瘤具有异质性，PD-L1表达在瘤内和瘤间存在一定的异质性。尽管多项研究对有关活检标本和手术后切除标本异质性的研究结果不一致。但有研究显示，增加取样点数可以保证组织微阵列样本与组织全切片样本PD-L1表达一致性＞90%，因此，采用活检标本进行PD-L1检测应保证足够的标本量。
术后复发和(或)转移患者，如采用原手术标本进行PD-L1检测，可能受标本储存条件和时长等影响，储存时间越长，对PD-L1检测结果影响越大。
应合理安排驱动基因检测和PD-L1检测，建议同时检测，当标本有限时，尤其是肺腺癌患者，应优先考虑驱动基因检测[EGFR、ALK和c-ros原癌基因1酪氨酸激酶(c-ros oncogene 1 receptor tyrosine kinase, ROS1)等]。
目前，仅组织学样本被批准用于PD-L1检测，细胞学标本尚未经过临床验证，实验室需做好充分的方法验证和质量控制，并在报告中予以适当说明，仅供临床参考。
四、PD-L1检测试剂和检测平台
1. PD-L1检测试剂主要包括22C3、28-8、SP142和SP263商业试剂盒，22C3作为帕博利珠单抗一线单药的伴随诊断，SP142作为阿替利珠单抗一线单药的伴随诊断(TC≥50%或IC≥10%)，28-8和SP263分别作为对应PD-1和(或)PD-L1单抗的补充诊断。另外，SP263被欧盟批准用于NSCLC患者帕博利珠单抗药物一线和二线以及Ⅲ期患者度伐利尤单抗药物的伴随诊断、纳武利尤单抗药物二线的补充诊断。
2. PD-L1检测平台主要包括DAKO和Ventana平台，其中22C3、28-8和73-10检测平台为DAKO平台;SP142和SP263为Ventana平台。
五、NSCLC PD-L1检测的判读标准
1. PD-L1检测所用抗体克隆不同其阳性阈值不同。
2. PD-L1染色阳性定义:22C3、28-8和SP263抗体的阳性定义为任何强度完整或部分肿瘤细胞胞膜染色，SP142抗体将阳性的肿瘤细胞和免疫细胞均纳入阳性标准中，具体判读标准见表3。
六、PD-L1抗体与检测平台的一致性
1. 22C3、28-8和SP263在肿瘤细胞中检测PD-L1表达一致性较好，而SP142在肿瘤中染色与22C3、28-8和SP263染色一致性较差。
2.关于实验室自建检测方法(laboratory developed tests, LDT)检测结果与试剂盒检测结果的一致性，目前各研究结果差异较大，运用LDT需谨慎。
国内外多项研究结果均显示，22C3、28-8和SP263对肿瘤细胞染色一致性较高，SP142与其他3个抗体在肿瘤细胞中染色一致性较差。LDT检测结果与商业试剂盒的检测结果存在不同程度的差异，影响因素较多。
七、针对不同的抗PD-1和(或)PD-L1药物，各种抗体间检测结果的互用性
1. 尽管多项研究结果表明，22C3、28-8和SP263一致性较高，目前尚缺乏足够的前瞻性临床研究证据支持抗体间检测结果互用的可行性。
2. 建议根据不同的抗PD-1和(或)PD-L1药物选择其对应的PD-L1检测抗体克隆及相应的检测平台。如果使用其他抗体克隆检测需在报告中予以注明。
在蓝印计划Ⅰ期研究中，选用4种抗体(22C3、28-8、SP142和SP263)对38例标本进行染色，各抗体使用匹配平台进行检测，判读阈值采用所有抗体对应临界(cut-off)值，结果表明，22C3采用28-8或SP263对应的cut-off值，28-8采用22C3或SP263对应的cut-off值，及SP263采用22C3或28-8对应的cut-off值进行判读，不同组合下所判读结果与自身抗体cut-off判读结果的一致率为86.8%~94.7%;SP142采用22C3、28-8和SP263的cut-off判读，一致率仅为63.2%~65.8%;22C3、28-8和SP263采用SP142判读标准，一致率仅为81.6%~86.8%。尽管研究中22C3、28-8和SP263染色相似，但22C3采用28-8或SP263对应的cut-off值，28-8采用22C3或SP263对应的cut-off值，以及SP263采用22C3或28-8对应的cut-off值判读仍存在5.3%~13.2%的不同，即采用不同的判读结果可能直接影响治疗方案的选择。
阿替利珠单抗的3项临床研究(IMpower150、IMpower110和OAK研究)对抗体互用性进行了初步探索，结果显示，SP142(TC或IC)、22C3(TC)和SP263(TC)抗体按各自判读标准筛选的PD-L1高表达水平人群具有较高的重叠，且临床获益较一致。鉴于目前仍缺乏前瞻性有效的临床研究数据支持抗体间检测结果互用的可行性，因此，建议根据不同的抗PD-1和(或)PD-L1药物选择其对应的PD-L1检测抗体克隆及相应的检测平台。如果使用其他抗体克隆检测在报告中要予以注明。
判读方面，多项NSCLC PD-L1表达判读一致性研究结果显示，采用22C3、28-8和SP263克隆，不同临床相关界值下经过相关培训的判读医师判读结果重复性高，且判读医师间判读结果一致性强，但仍然存在10%~15%左右的不一致率，尤其是对于临近阈值的病例。切实有效的判读培训对提高判读医师结果一致性来说至关重要。
八、实验室自建检测方法(LDT)
1. LDT的性能确认和验证面临严峻挑战。
2. 多项有关PD-L1的LDT与获批诊断试剂盒一致性评估的研究结果不一致，LDT检测应用于临床检测需谨慎，LDT需要严格的方法验证和质量控制。
国内病理科PD-L1检测存在自动染色多平台的普及率低、病理组织样本有限和试剂盒价格高等实际问题，LDT可能作为潜在的解决策略。所谓LDT即实验室自建检测，通俗地讲，除经临床试验验证的检测(包括抗体、检测试剂盒、评分方法、质控系统和检测所需要的设备在内的一整套完整体系)外，其他PD-L1检测均为LDT。目前，关于LDT与获批试剂盒一致性研究结果差异较大，法国一致性研究选用41例样本，分别在7个中心进行了35种PD-L1检测(30个实验方案)，结果显示，使用试剂盒的检测，肿瘤细胞染色一致性较高，27种基于DAKO、Ventana和Leica平台的LDT检测中，仅14种(51.8%)LDT肿瘤细胞染色与试剂盒对照组较一致，免疫细胞染色一致性都较差。因此，使用LDT需谨慎，需要严格的方法验证及质量控制。
九、PD-L1检测的质控要点
为确保准确规范地进行PD-L1检测，检测实验室应在开展PD-L1检测前针对不同抗体克隆建立规范化操作流程并进行必要的性能验证，切实做好PD-L1检测的质量控制工作，包括实验室内部质控和外部质控。
1. 内部质控:(1)检测前:PD-L1检测前标本类型、冷缺血时间、固定液选择及固定时间、切片制作及白片、蜡块储存时间和储存条件等均不同程度对PD-L1检测造成影响。冷缺血时间指标本离体到浸入固定液之间的时间，建议不超过60 min;固定液建议选择10%中性福尔马林(SP263检测可使用锌福尔马林作替代)，固定液和组织的体积比至少为10∶1，手术切除标本固定24~48 h(不超过72 h)，活检标本和细胞蜡块固定6~48 h，固定时间延长会导致PD-L1表达降低;切片制作要求3~4 μm的涂胶白片，储存时间建议不超过2个月(2℃~8℃可保存12个月)，储存时间延长可能导致PD-L1检测的假阴性;蜡块储存时间建议不超过3年。(2)检测中:PD-L1检测影响因素包括抗体种类、浓度、剂量、抗原修复、孵育时间、孵育温度和信号增强等，应根据临床治疗药物需求选择对应的抗体克隆，遵照商业化试剂盒说明书要求规范化检测，切实做好每一批次PD-L1检测的质量控制;(3)检测后:①准确的结果判读:首先对阴阳性对照进行判读，在染色满意的情况下进一步对患者染色切片进行判读，顺序依次为阴阳性对照片→苏木素-伊红染色切片→IHC染色切片。PD-L1判读过程中严格按照克隆要求的最低肿瘤细胞数、判读细胞类型、染色模式和cut-off值进行判读。②对判读医师严格的培训:在PD-L1判读实践中，判读过程中存在很多潜在陷阱，且不同检测其判读标准不同，切实有效的判读者培训十分必要;实验室应定期组织判读医师进行人员比对、针对性培训及数据总结和分析。③规范化报告:PD-L1检测结果报告除包含常规病理报告的基本内容和患者基本信息外，还应包括但不限于以下内容:抗体克隆号、自动染色平台、商业化试剂盒或LDT、阳性和(或)阴性对照评估、选用的cut-off值、检测结果以及必要的注释。参考报告模板见表4。
2. 外部质控:实验室应定期参加室间质评活动，每年至少2次。主要通过参加国内权威机构(病理质控中心)举办的室间质评活动来完成，或进行可靠的实验室间比对。
十、其他免疫治疗生物标志物
1. 目前NSCLC免疫治疗临床实践中主要应用的生物标志物包括PD-L1表达和肿瘤突变负荷(tumor mutation burden, TMB)。PD-L1表达与TMB无相关性。
2. 考虑到PD-L1表达检测简单便捷，而TMB相对复杂，价格较贵，建议采取先测PD-L1再测TMB的策略;有条件者可同时检测PD-L1和TMB。
TMB指肿瘤细胞基因组中，所评估基因的编码区发生置换和插入和(或)失性突变(体细胞突变)的总数，通常按每兆碱基(Mb)中的突变数计算。CheckMate026研究首次在前瞻性队列中证实了TMB对免疫治疗具有预测作用，高TMB者应用纳武利尤单抗治疗显著获益，其中PD-L1表达(TPS≥50%)者PFS获益更为明显。KEYNOTE010、KEYNOTE042、POPLAR和OAK研究亦显示，帕博利珠单抗和阿替利珠单抗单药治疗疗效与TMB呈正相关。然而，在系列化疗联合PD-1抑制剂临床研究中，未观察到TMB与化疗联合免疫治疗疗效的相关性。另外，TMB检测成本高、普及率低、有效cut-off值不确定、组织样本和血液样本TMB结果一致性及缺乏前瞻性研究等，在一定程度上均限制了其广泛的临床应用。
除了PD-L1表达和TMB，另一个重要的标志物是微卫星不稳定(microsatellite instability, MSI)。MSI的IHC检测包括对4个错配修复蛋白表达的检测，聚合酶链式反应可以对5个微卫星位点进行检测。高度微卫星不稳定(microsatellite instability high, MSI-H)的肿瘤多为高TMB，两者存在一定相关性。反之，高TMB的患者不一定是MSI-H。
在临床实践中，PD-L1表达、TMB和MSI 3个标志物相互独立。肺癌中MSI-H病例非常少见，临床主要检测PD-L1表达和TMB。考虑到PD-L1表达检测简单便捷，而TMB相对复杂，价格较贵，建议采取先检测PD-L1，再检测TMB的策略;有条件者可同时检测PD-L1和TMB。
另外，肿瘤免疫微环境中免疫细胞的表达谱正逐渐被认识，并可能作为肿瘤免疫治疗的预测标志物。本共识要点总结见表5。
共识要点推荐级别:(1)强烈推荐:基于高或中级别证据，可信度高;(2)推荐:基于中级别或低级别证据，但具有一些局限性，专家组同意推荐;(3)专家共识意见:基于低级别证据或缺乏证据，但专家组统一意见。
本共识初稿完成后，针对初稿内容发起专家投票，共收回专家投票结果40份，有超过80%的专家对其中15个要点持支持意见，共识编写组成员对2个支持率未达80%的要点仅在正文中予以体现，尚待后续进一步完善。
免责声明 本专家共识内容由专家组成员依据现有医学证据及实践经验共同讨论形成，以帮助相关人员进行PD-L1检测或临床决策，其中的内容可能不够全面或不够充分。医学知识发展迅速，在本共识产生到发表期间均可能出现新的证据，而这些可能并没有体现在本共识中。另外，因检测流程复杂、实验室条件差异以及患者之间存在个体差异等影响检测决策或结果，因此，本共识中内容的采用应结合检测条件、政策许可以及专业人员的独立专业判断。对本共识内容的使用是自愿的。专家组成员明确否认对文中所提及的任何产品具有商业性目的。专家组对因使用本共识内容而造成的或与之相关的任何人身伤害或财产损失，或任何错误或遗漏不承担任何责任。本共识经过临床病理专家投票认可。
