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用Tunel法搞定石蜡切片/冰冻切片/细胞涂片的凋亡检测方法
更新时间:2021/2/1   浏览量:1105
 

Tunel法常用于检测细胞凋亡,其原理为细胞凋亡发生时,相关DNA内切酶会被激活,从而切断核小体间的DNA。在细胞凋亡晚期,DNA会被降解为180-200 bp的片段。TdT介导的dUTP末端标记法(TUNEL)是在TdT的催化下将荧光素标记的dUTP与断裂DNA暴露的3'-OH聚合,延伸后的DNA可通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测。

Tunel试剂盒适用于组织样本(石蜡切片、冰冻切片)和细胞样本(细胞涂片)在单细胞水平上的凋亡原位检测。今天就为大家介绍三种样品的处理方法:

一.石蜡切片

1)脱蜡与水化:将切片依次放入二甲苯I(15min)→二甲苯II(15min)→100%乙醇(5min)→95%乙醇(5min)→90%乙醇(5min)→85%乙醇(5min)→80%乙醇(5min)→70%乙醇(5min)→ddH2O冲洗5min,重复3次;
2)用组化笔圈好组织,在每个样品上滴加20μg/ml不含DNase I的蛋白酶(PK),20-37℃作用15-30min;
3)1×PBS洗5min,3次,洗净PK;

二.冰冻切片

1)1×PBS洗5min,3次。

2)用组化笔圈好组织,在每个样品上滴加20μg/ml不含DNase I的蛋白酶(PK),20-37℃作用15-30min;
3)1×PBS洗5min,3次,洗净PK;

三.细胞涂片:

1)固定细胞,将载玻片浸入装有4%新鲜配制于PBS中的多聚甲醛的染色缸中,在4℃放置25min。
2)洗涤载玻片,将其浸入PBS中,室温放置5min。重复用PBS洗一次。动作要轻柔,防止细胞脱片。
3)轻轻去掉多余液体,并用滤纸小心吸干玻片上样本周围多余的液体。
4) 每个样本上滴加20μg/ml不含DNase I的蛋白酶(PK),20-37℃作用5min;
5)1×PBS洗5min,3次,洗净PK;

三种样品处理的方法略有不同,最关键的差别在于蛋白酶(PK)的处理时间,一般组织样品处理的时间略长,细胞处理时间最好控制在几分钟内,防止样品通透过度,造成组织或细胞脱片。样品处理好之后,后续的阳性对照处理与检测方法相同,即:

1)阳性对照制备:按1:10的比例用ddH2O稀释10×DNase I Buffer,取其中100µl滴加到已通透的样本上,室温孵育5min。向剩余100μl 1×DNase I Buffer中加1μl DNase I(1U/μl)。洗掉液体,加入100μl含DNase I的缓冲液,室温孵育10min。洗掉液体,并将载玻片放入1×PBS洗5min,3次;
2)按1:5的比例用ddH2O稀释5×Equilibration Buffer。将四组样本分别滴加100μl 1×Equilibration Buffer覆盖样本,室温孵育10-30min;
3)Tunel检测液按照下列表格配制,检测液需充分混匀。阴性对照组配制过程中不加TdT酶的对照孵育缓冲液,用ddH2O替代TdT酶;
试剂    体积(50μl)
ddH2O    34μl
5×Equilibration Buffer    10μl
FITC-12-dUTP Labling Mix    5μl
Recombinant TdT Enzyme    1μl
4)将载玻片上的100μl 1×Equilibration Buffer洗掉,再加入50μl TdT孵育缓冲液;
5)将载玻片置于湿盒内,37℃避光孵育60min,后续步骤注意避光操作;
6)1×PBS洗5min,重复一次;
7)轻轻擦掉样本周围及背面的PBS溶液。为了降低背景,载玻片在用PBS洗一遍后,可再用含0.1% Triton X-100和5mg/ml BSA的PBS洗5min,3次;
8)向玻片上滴加DAPI避光孵育5-10min,复染细胞核;
9)1×PBS 洗5min,3次,洗去多余的DAPI;
10)用吸水纸吸干玻片上的液体,用含抗荧光淬灭剂的封片液封片;
11)共聚焦荧光显微镜下观察并采集图像。

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