Tunel法常用于检测细胞凋亡，其原理为细胞凋亡发生时，相关DNA内切酶会被激活，从而切断核小体间的DNA。在细胞凋亡晚期，DNA会被降解为180-200 bp的片段。TdT介导的dUTP末端标记法（TUNEL）是在TdT的催化下将荧光素标记的dUTP与断裂DNA暴露的3'-OH聚合，延伸后的DNA可通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测。

Tunel试剂盒适用于组织样本（石蜡切片、冰冻切片）和细胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。今天就为大家介绍三种样品的处理方法：

一.石蜡切片

1）脱蜡与水化：将切片依次放入二甲苯I（15min）→二甲苯II（15min）→100％乙醇（5min）→95％乙醇（5min）→90％乙醇（5min）→85％乙醇（5min）→80％乙醇（5min）→70％乙醇（5min）→ddH2O冲洗5min，重复3次；
2）用组化笔圈好组织，在每个样品上滴加20μg/ml不含DNase I的蛋白酶(PK），20-37℃作用15-30min；
3）1×PBS洗5min，3次，洗净PK；

二.冰冻切片

1）1×PBS洗5min，3次。

2）用组化笔圈好组织，在每个样品上滴加20μg/ml不含DNase I的蛋白酶(PK），20-37℃作用15-30min；
3）1×PBS洗5min，3次，洗净PK；

三.细胞涂片：

1）固定细胞，将载玻片浸入装有4%新鲜配制于PBS中的多聚甲醛的染色缸中，在4℃放置25min。
2）洗涤载玻片，将其浸入PBS中，室温放置5min。重复用PBS洗一次。动作要轻柔，防止细胞脱片。
3）轻轻去掉多余液体，并用滤纸小心吸干玻片上样本周围多余的液体。
4） 每个样本上滴加20μg/ml不含DNase I的蛋白酶(PK），20-37℃作用5min；
5）1×PBS洗5min，3次，洗净PK；

三种样品处理的方法略有不同，最关键的差别在于蛋白酶(PK）的处理时间，一般组织样品处理的时间略长，细胞处理时间最好控制在几分钟内，防止样品通透过度，造成组织或细胞脱片。样品处理好之后，后续的阳性对照处理与检测方法相同，即：

1）阳性对照制备：按1:10的比例用ddH2O稀释10×DNase I Buffer，取其中100µl滴加到已通透的样本上，室温孵育5min。向剩余100μl 1×DNase I Buffer中加1μl DNase I(1U/μl)。洗掉液体，加入100μl含DNase I的缓冲液，室温孵育10min。洗掉液体，并将载玻片放入1×PBS洗5min，3次；
2）按1:5的比例用ddH2O稀释5×Equilibration Buffer。将四组样本分别滴加100μl 1×Equilibration Buffer覆盖样本，室温孵育10-30min；
3）Tunel检测液按照下列表格配制，检测液需充分混匀。阴性对照组配制过程中不加TdT酶的对照孵育缓冲液，用ddH2O替代TdT酶；
试剂    体积（50μl）
ddH2O    34μl
5×Equilibration Buffer    10μl
FITC-12-dUTP Labling Mix    5μl
Recombinant TdT Enzyme    1μl
4）将载玻片上的100μl 1×Equilibration Buffer洗掉，再加入50μl TdT孵育缓冲液；
5）将载玻片置于湿盒内，37℃避光孵育60min，后续步骤注意避光操作；
6）1×PBS洗5min，重复一次；
7）轻轻擦掉样本周围及背面的PBS溶液。为了降低背景，载玻片在用PBS洗一遍后，可再用含0.1% Triton X-100和5mg/ml BSA的PBS洗5min，3次；
8）向玻片上滴加DAPI避光孵育5-10min，复染细胞核；
9）1×PBS 洗5min，3次，洗去多余的DAPI；
10）用吸水纸吸干玻片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片；
11）共聚焦荧光显微镜下观察并采集图像。