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石蜡切片制备(取材与固定、水洗、脱水、透明、包埋)
更新时间:2021/2/1   浏览量:1194
  取材与固定
切取组织时应使用锋利的刀、剪,切取组织块时,从刀的根部开始向后拉动切开组织。组织块的厚度约为0.2~0.3cm,大小为1.5cm x 1.5cm x 0.3cm为宜。取好的组织块用10%缓冲中性福尔马林(甲醛)液固定24~48h。
10&福尔马林(甲醛):100ml甲醛+900ml水。
10%缓冲中性福尔马林(甲醛)液:100ml甲醛+900ml水+4gNaH2PO4+6.5gNa2HPO4。
NBF另一配方:50ml甲醛+450ml水+8.18425gNa2HPO4*12H2O+2.2666gNa2HPO*2H2O
10%中性福尔马林(甲醛)液:100ml甲醛+900ml水+碳酸钙加至饱和 (以容器底部碳酸钙沉淀1~2cm厚为适度)充分振荡混合后,放置24小时取上清液使用。

固定液的用量一般为组织体积的10~20倍,容器不要过小,材料也不要太多;应避免组织紧贴瓶底或瓶壁,以免影响固定液的渗入。


水洗
固定后的组织块的冲洗,一般情况下是置水龙头下以自来水流水冲洗,这样可以使组织中的固定液随时溢出,洗得更干净彻底,有些还需要进行特殊的洗涤。
各种以水配制的固定液如甲醛,都必须用流水冲洗,大块组织一般冲洗24小时,小块组织一般冲洗2—10小时。
固定液为多聚甲醛时,用于免疫组织化学等特殊染色的应将组织投入PB缓冲液中,每60分钟更新洗涤液一次,累计6小时。冲洗好的组织可存放在75%酒精内
脱水
从30%乙醇开始,经过50%、70%、80%、95%、100%至完全脱水。一般各级乙醇中放置45min到1h。

脱水必须在有盖瓶中进行,以防止高浓度乙醇吸收空气中水分导致浓度降低而使脱水不彻底。需要保存的材料可脱水至70%乙醇时停留其中,如需长期保存,可加入等量的甘油。


透明

二甲苯作用较快,透明力强,但组织块在其中停留过久,容易收缩变脆变硬,同时若脱水不净,就会引起不良后果,在应用时必须特别小心。通常将组织块先经纯乙醇与二甲苯的等体积混合液,再进入纯二甲苯,这样可减少上述的缺点。透明时间应由组织大小而定,—般各级停留时间在30min至2h,在纯二甲苯中应更换2次,总时间则以不超过3h为宜。材料经过透明,会显示出前一步脱水的效果如何,若脱水彻底,组织则显现透明状态,如组织中有白色云雾状,说明脱水不净,须返工处理,但返工的效果往往不好。使用二甲苯透明时,应避免其挥发和吸收空气中的水分,并保持其无水状态


透腊
透蜡须在恒温箱中进行,恒温箱的温度调节至高于石蜡熔点3度,使经过透明的组织块依次用石蜡与二甲苯的等量混合液、纯石蜡处理。纯石蜡应处理2~3次,透蜡的时间依材料性质而定,一般每次需15~30min。

在60度恒温蜡箱中放置3个蜡杯,分别编号1(52℃~54℃)、2(52℃~54℃,或54℃~56℃)、3(56℃~58℃),其中分别盛软蜡、软蜡、硬蜡,取透明好的组织块放入软蜡中各1小时,迅速取出放入硬蜡,如果时间来及包埋,可以将已经完成浸蜡的组织块取出放在温箱外,第二天继续。


包埋
包埋是使浸透蜡的组织块包裹在石蜡中。具体做法是;先准备好纸盒,将熔蜡倒入盒内,迅速用预温的镊子夹取组织块平放在纸盒底部,切面朝下,再轻轻提起纸盒,平放在冷水中,待表面石蜡凝固后立即将纸盒按入水中,使其迅速冷却凝固,30min后取出。
包埋用蜡的温度应略高于透蜡温度,保证组织块与周围石蜡完全融为一体。石蜡的迅速冷却也很重要,否则包埋块中将会产生结晶。以后切片时引起碎裂。
①准备包埋蜡:一般应用硬蜡(56~58℃或60~62℃)为好,所用的石蜡要求透明无杂质,新的石蜡要反复熔凝,并有一定的粘韧性,可以加一些蜂蜡。蜡的熔点应与组织的硬度相适应。包埋用过的石蜡可以反复使用。
②准备包埋框:可以用金属的,也可以用硬纸摺叠。
③点燃酒精灯,准备好无齿尖镊子,需作标记应先写好标签。
④在金属框中倒入硬蜡,然后用无齿镊子取组织块放入石蜡中,置好方向。可室温下冷却。
⑤包埋框或纸盒内的蜡逐渐凝结,若表面已凝结形成一层固体状,即可放入冷水中,加速其凝固。

⑥待蜡块完全凝固以后,便可拆卸包埋框架, 或拆开纸盒,取出蜡块。


切片

展片、捞片和贴片


烤片

展好的切片在室温下稍微干燥后,放在40℃恒温烤箱中,小片组织30分钟即可,大的需12~24小时,烤干备用。


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